Equipamentos

Microscópio de fluorescência confocal

O Grupo de Fluorescência Molecular montou seus próprios microscópios de fluorescência, o que oferece uma maior versatilidade do aparato instrumental para atender as diferentes demandas de pesquisa e, ao mesmo tempo, incentiva os seus estudantes a entenderem na prática os detalhes das técnicas de microscopia de fluorescência. Acreditamos que quando o estudante se sente participante da montagem instrumental ele desenvolve uma visão mais sistêmica de seu experimento, contribuindo para uma formação mais multi-disciplinar. O layout óptico de nosso microscópio confocal e de todos os seus recursos que foram implementados são apresentados na figura 1.

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Figura 1 – Layout óptico do setup de microscopia de fluorescência confocal. APD: avalanche photodiode, BS: beam splitter, CU: control unit, D: doublet, DF: dichroic filter, EXP: beam expander, IR: iris diaphragm, L: lens, LPF: low pass filter, M: mirror, MM: movable mirror, NF: notch filter, NLC: non-linear crystal, OB: objective, OF: optical fiber, PBS: prism beam splitter, PA: piezoelectric actuator, PH: pinhole, PP: pulse picker, S: sample, SD: silicon detector, WP: wave plate.

Com esse microscópio é possível obter imagens de microscopia de fluorescência confocal bi e tri-dimensionais, bem como espectros de emissão e curvas de decaimento para regiões específicas da amostra. Nossas linhas de laser CW estão em 405, 473 e 532 nm, e também possuímos linhas pulsadas em 800 e 400 nm, permitindo obter as curvas de decaimento e imagens com absorção de um ou dois fótons. Na figura 2 segue uma fotografia da montagem desse microscópio em nosso laboratório.

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Figura 2 – Foto do setup experimental para microscopia de fluorescência confocal.

Microscópio de fluorescência Wide Field / TIRF

Para oferecer recursos de investigação complementares a microscopia de fluorescência confocal, desenvolvemos também os nossos próprios microscópios de fluorescência de campo largo (wide field). Com esta técnica é possível estudar a dinâmica e atividade de reações químicas a nível de moléculas individuais bem como realizar estudos de intermitência de fluorescência. Nesse caso, uma região ampla da amostra é iluminada e a imagem da fluorescência é gerada em um sensor matricial do tipo EMCCD, de alta eficiência quântica e velocidade e baixos níveis de ruído. Na figura 3 segue o layout óptico e todos os recursos utilizados nessa técnica.

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Figura 3 – Layout óptico do setup de microscopia de fluorescência wide field. BFP: objective back focal plane, CAA: camera coupling assembly, CU: control unit, DF: dichroic filter, EXP: beam expander, IR: iris diaphragm, M: mirror, MM: movable mirror, NF: notch filter, OB: objective, P: prism, PFD: pre-focusing doublet, S: sample, WP: wave plate.

Utilizando objetivas especiais com abertura numérica de 1.49, implementamos também a técnica de microscopia de fluorescência por reflexão total interna (TIRFM, da sigla em inglês), onde apenas uma onda evanescente entre a lamínula e o meio da amostra é que realiza a excitação. Essa é uma metodologia muito utilizada para a investigação de sistemas biológicos em meio aquoso e oferece uma maior relação Sinal / Background em comparação com a microscopia wide field, tendo em vista que a excitação se dá apenas em um plano definido. Na figura 4 são comparadas as técnicas de microscopia de fluorescência wide field, TIRF e confocal.

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Figura 4: Comparação das métodos de excitação para as técnicas de microscopia wide field (esquerda), TIRF (centro) e confocal (direita).

Uma fotografia da montagem experimental dessa técnica é apresentada na figura 5.

GFM_microscopio_widefield

Figura 5: Foto do setup experimental para microscopia de fluorescência wide field e TIRF.

Utilizando esta montagem experimental também são realizados no GFM estudos empregando técnicas de super-resolução óptica, baseados na localização do centróide da Point-Spread Function resultante do imageamento de moléculas individuais. Esta metodologia é esquematicamente apresentada na figura 6.

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Figura 6: Metodologia empregada nas técnicas de super-resolução óptica baseadas no princípio de localização do centróide da PSF resultante do imageamento de moléculas individuais.

Espectroscopia de fluorescência resolvida no tempo

O GFM possui grande experiência nas técnicas de espectroscopia de fluorescência resolvida no tempo por contagem de fótons (Single Photon Counting). Segue abaixo uma fotografia dessa montagem experimental.

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Figura 7: Foto do setup experimental para espectroscopia de fluorescência resolvida no tempo.

Instrumentação Química

(Em desenvolvimento)

Facilidades institucionais

(Em desenvolvimento)